E-192在人類雙羥擬脂醯胺去氫酶反應機制中所扮演的角色

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题名:	E-192在人類雙羥擬脂醯胺去氫酶反應機制中所扮演的角色
作者:	施智尹
贡献者:	中山醫學院營養科學研究所
日期:	1999
上传时间:	2022-11-14T08:16:43Z (UTC)
摘要:	雙在擬脂瞌胺去氫昌每(dihydrolipoamide dehydrogenase; E3) 是屬於臼祟。令核苔雙硫氧化選擇、梅家族之一。此族群主要特徵是具有活性雙硫基(active disulfide) 、活性鹼基(active base)和FAD' 其活性中心可在電子接受者(NAD+ 或NADP+)與雙硫基受質(dithiol substrate)之間傳遞電子;見也是哺乳類的蚵敢去氫晦複合體包括丙酌酸去氫鵲複合體(pyruvate dehydrogenase complex, PDC) 、α"酹戊二酸去氫時複合體(α-ketoglutarate dehydrogenase complex, KGDC)及側鏈盟內酸去氫晦複合體(branched-chainα-keto acid dehydrogenase complex, BCKADC) 等三種複合體的共同組成成份，所以當旦發生缺乏或有缺陷時，三種朝自主去氫晦複合體的活性均會受到影響，因此扎在能量代謝上佔有舉足輕重的地位。所以本實驗研究的目的即是探討吼: E192 在巴反應機制及電子傳遞路徑上扮演的角色。其研究方法首先利用定點突變方法創造出E192Q 這個突變蛋白質，隨後利用分子量測定、FAD 含量測定、酵素動力學分析、光譜分析及氧化還原電位測定等方法，來探討酵素結構與功能闊的關像。經由分子量測定發現突變蛋白質與正常蛋白質其分子量大致相同，約為 100kDa; 換言之突變並不會影響其同質雙體(homodimer) 的結構。酵素相對的FAD 含量比E3 : E192Q 為100 : 95 。而在酵素動力學分析中E192Q 之代謝迴轉速率 (Kcat)約只為正章見的10% 。令人驚奇的是E192Q 突變蛋白正反應的反應機制從正常凹的乎其反應、(ping pong mechanism) 變成序列機制(sequential mechanism) 。進一步在螢光光譜分析中發現E192Q 突變蛋白從DHL 傳遞電子至FAD 形成FADH' 再進一步的將NAD+還原產生NADH 之反應途徑幾乎完全被阻斷，隨後的紫外光/可見光光譜分析則發現E192Q 突變蛋白在530nm 雙硫基與FAD 闊的電價轉移階段其電子傳遞緩慢而近乎停滯;而在氧化還原電位中點分析中， E192Q 突變蛋白的FAD 還房、電位中點和巴相比別發現有升高的現象產生。由以上結果推論E192Q 的代謝迴轉率的大幅下降可能是因為突變致使FAD 無法被順利還原成FADH 進而使電子傳遞路徑的受阻所導致。所以推測E192 參與電子傳遞，可能是五活性中心的成員之一，其對於活化中心的穩定和酵素功能的維持具有關建性的影響，在扎的反應機制中確實扮演一個非常重要的角色。 n
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