多重轉譯體分析微角塵?在上皮細胞內誘發的發炎反應

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Title:	多重轉譯體分析微角塵?在上皮細胞內誘發的發炎反應 Multiplex transcriptome profile analysis for the crude allergens from Dermatophagoides microceras involved the inflammatory responses in the epithelium cell treatments
Authors:	馮天浩 Tien-Hao Feng
Contributors:	醫學科技學院:生物醫學科學學系;劉玉凡(Yu-Fan Liu)
Keywords:	家塵?;微角塵?;次世代定序;全轉錄體分析;氣喘;第一型糖尿病;凝血纖維蛋白 house dust mite;Next-Generation Sequencing;Der m;Rna-Seq;Asthma;Type I diabetes;Fibrinogen
Date:	2021-07-01
Issue Date:	2022-08-01T09:24:26Z (UTC)
Abstract:	[Background] 家塵? (House dust mites, HDMs) 是誘發氣喘的重要過敏原。台灣存在有3種常見的HDMs品種，包括: 微角塵? (Dermatophagoides microceras, Der m)，屋塵? (Dermatophagoides pteronyssinus, Der p)與粉塵? (Dermatophagoides farinaea, Der f)。前期的研究顯示台灣中部地區的462位特異反應性 (atopy) 過敏幼童 (2-16歲)，有高達 80% 以上病患特別對微角塵?，具有致敏作用 (sensitization)，因此本研究專題將探討微角塵?致敏原，刺激人類上皮細胞的致敏機制，透過致敏機制的分析，藉此建立呼吸道修補 (Airway remodeling) 的療效評估。 [Methods] 採用多重轉譯體分析 (Multiplex transcriptional profile analysis)，分別進行Der p、Der f與Der m粗萃取液處理下，探討誘發人支氣管上皮細胞 (BEAS-2B) 的全轉錄基因圖譜。採取不同的時間 ( 4和24小時 ) 及不同處理條件下，共十六組樣品的RNA-seq資料，包括: 對照組、家塵?處理組、纖維蛋白原組 (fibrinogen, 重要的凝血因子 )、Der m 2組 ( 主要致敏原 )、合成皮質類固醇藥物處理組(Dexamethasone, Dexa)。其中分析三種粗萃過敏原蛋白粗萃物 (Der m、Der p和Der f)、Dexa + Der m治療組，及 Der m 作用於凝血因子，不同時間點的水解產物 (fibrinogen cleavage products, FCPs) 分別加入主要致敏原 Der m 2。採用次世代測序技術，使用Hisat2，featureCounts和DESeq等全轉錄基因的分析流程，並應用基因富集分析 (Gene Set Enrichment Analysis, GSEA) 配合京都基因與基因組百科全書 (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG) 與基因本體 (Gene Ontology, GO)資料庫的註解。透用Real-time PCR及Western blot分別針對目標基因表達與蛋白質層次的再驗證工作。 [Results] 使用三種粗萃過敏原蛋白提取物 (Der m、Der p和Der f) 處理的4小時組中的細胞因子 (IL-6和IL-8) 基因表現量高於24小時組的5-8倍，顯示致敏原誘發的發炎反應在4小時達到高點；首先應用GSEA於KEGG發現三種致敏原所誘發的共同富集路徑分別為Toll-like受體信號轉導通路 (P-value=0.0001)、Nod-like受體信號通路 (P-value =0.0007)、和Jak-Stat信號通路途徑 (P-value =0.0004)，並且利用Real-time PCR分別在驗證參與Toll-like受體信號轉導路徑的作用基因IL-6, IL-8, NFκB1, PIK3R1, TBK1與RNA-Seq分析的結果一致，並利用Western blot再探討蛋白質的作用機制，核轉錄因子NF-κB會在刺激後30min由細胞質進入細胞核，並啟動下游基因的調控。其次分析Der m處理下的特有富集基因，是與第一型糖尿病的調控有關(P-value =0.0001)，其中上調基因有IL-12A，IL-1與HLA-II，並透過Real-time PCR再驗證了促T細胞增殖因子IL-12A為Der m誘發致敏作用的特有基因。接著在Dexa + Der M治療組中，利用GO資料庫的4D scatter plot，顯示藥物治療所影響的特有基因，經富集後有纖毛組成(Cilium Organization, P-value =8.29x10-8)、運動纖毛 (Motile Cilia, P-value =1.05x10-7) 及微管細胞骨架 (Microtubule Cytoskeleton, P-value =3.41x10-6) 等分子功能。最後針對主要過敏原作用的分析中，顯示1分鐘 FCPs加入 Der m 2組別中所誘發的發炎反應具協同性的加乘作用 (synergistically effect)，而利用富集分析的結果，顯示對細胞連結 (Adherens junction, (P-value =0.0003) 調控基因具有上調作用，說明FCPs透過細胞結合素(Nectins) 傳遞訊號，來重組肌動蛋白及細胞骨架改變細胞通透性來調節Adherens junction的形成，改變細胞間黏附的作用。[Conclusion] 結果顯示，三種家塵?的過敏原蛋白萃取物，誘發上皮細胞的致敏機制是共同經由Toll-like受體信號轉導通路，來引起核轉錄因子NF-κB進入細胞核使促發炎細胞因子的上調作用。另一方面暴露於微角塵?的環境下，相較其他兩種家塵?的致敏作用更容易導致β-cell失去功能死亡而引發第一型糖尿病。在藥物治療組別中發現Dexa有調節纖毛組成、及微管細胞組成等分子功能。最後，經微角塵?處理後的 FCPs會導致Der m 2經由細胞結合素 (Nectins)傳遞訊號來調節Adherens junction的形成及改變細胞間的黏附作用，藉此增加主要過敏原Der m 2所誘發的發炎反應協同性的加乘作用。
URI:	https://etds.csmu.edu.tw/ETDS/Home/Detail/U0003-1205202111403300 https://dx.doi.org/10.6834/csmu202100054 https://hdl.handle.net/11296/vx4uba https://ir.csmu.edu.tw:8080/handle/310902500/23104
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