蛋白質精胺酸甲基接受蛋白之研究---重組fibrillarin之甲基化分析及淋巴母細胞甲基接受蛋白之蛋白體分析

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Title:	蛋白質精胺酸甲基接受蛋白之研究---重組fibrillarin之甲基化分析及淋巴母細胞甲基接受蛋白之蛋白體分析
Authors:	黃宏明 Hung-Ming Huang
Contributors:	中山醫學大學：醫學研究所;李娟
Keywords:	蛋白質精胺酸甲基轉移脢;二維性電泳分析;蛋白體分析
Date:	2001
Issue Date:	2010-04-23T08:13:35Z (UTC)
Abstract:	蛋白質精胺酸的甲基化，常見於一些RNA結合蛋白，且是發生於arginine-glycine-glycine (RGG)重複的序列中，如fibrillarin。在之前的研究中，雖已證實fibrillarin確為精胺酸甲基接受蛋白，但對於其發生甲基化的機制與特性，卻仍是不清楚的。在我們的實驗中，利用重組的fibrillarin，進行in vitro甲基化反應，配合蛋白內切脢與fluorography的結果，針對fibrillarin發生於其RGG domain中的精胺酸甲基化現象，作了進一步的探討。另外，在之前的研究，已知淋巴母細胞中富含精胺酸甲基接受蛋白，為了更進一步研究這些蛋白，在我們的實驗中，利用了蛋白體 (Proteomic)分析的技術，使用了二維膠電泳 (2-dimensional gel electrophoresis)及MALDI-TOF-MS的分析，對這些蛋白作了進一步的鑑定。我們配合使用甲基轉移脢抑制劑AdOx，獲取低甲基化狀態的萃取蛋白，方便進行in vitro甲基化分析。將淋巴母細胞培養在加入或不加入AdOx的環境中，取得的萃取蛋白在跑完2D gel後，以分析軟體進行比對，但未見彼此間有顯著的差異性。而在以＋AdOx的淋巴母細胞萃取蛋白，利用重組之酵母菌甲基轉移脢RMT1進行完in vitro甲基化反應，以2D gel進行分析後，根據fluorography的結果，取有甲基化反應的蛋白spots，使用蛋白內切脢作in gel digestion，再將產物進行MALDI-TOF-MS的分析。之後以線上軟體，至資料庫中鑑定這些蛋白。但其中的Protein disulfide isomerase (PDI)在後續的研究中，無法進一步確認有精胺酸甲基化的反應，而另外二點鑑定出的hnRNP A2/B1，則是和過去已知的甲基化研究相符合。最後，我們並以mass分析的資料，對hnRNP A2/B1發生甲基化的位置，提供了初步的證據。這或許正指引了進一步探討蛋白質甲基化的研究方向。
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